3'-O-Acetyl-2',7'-bis(carboxyethyl)-4 or 5-carboxyfluorescein, diacetoxymethyl ester3'-O-乙酰胺-2',7'-二(羧乙基)-4或5-羧基荧光素,二乙酰甲酯，BCECF AM是一种对细胞内pH敏感的新型荧光探针，分别用490 nm和440 nm波长激发BCECF所得到的发射荧光之比与pH有很好的线性关系。BCECF AM是乙酰甲酯化的BCECF，BCECF-AM是一种可以穿透细胞膜的荧光染料，BCECF-AM没有荧光，进入细胞后被细胞内的酯酶水解成BCECF，从而被留在细胞内。BCECF在适当的pH值情况下可以被激发形成绿色荧光。BCECF AM不仅被广泛用于哺乳动物细胞的研究，也有报道用于动物组织、植物细胞、细菌和酵母等的细胞内pH水平检测。在有细胞内pH变化的细胞毒性、细胞凋亡、细胞粘附、药物抵抗、细胞趋化等过程中BCECF AM被广泛应用。BCECF AM (pH荧光探针)需用无水DMSO(anhydrous DMSO)配制

产品特性：

7.0 的 pKa 值是理想匹配到正常范围的细胞质的 pH（约为 6.8-7.4）；

荧光激发特性是 pH 依赖型，可以进行比率测定；

具有最大吸光度的 BCECF 碱形式激发谱非常接近 488 nm 氩激发，适合应用于激光共聚焦显微镜及流式细胞仪。

实验步骤：

配制 BCECF, AM 储存液

BCECF AM 需用无水 DMSO 配制，配制成 1~10 mM 的储存液。BCECF AM 储存液置于 ≤–20°C 干燥条件下保存。按照推荐的储存条件，该储存液可稳定保存至少 6 个月。常用的 BCECF, AM 工作液浓度为 1～10 μM，使用去离子水进行稀释，现用现配，不建议将工作液进行保存。

哺乳动物细胞染色：

低浓度的 BCECF AM 染色哺乳动物细胞时，大多数情况下可不经细胞透化处理。当染料分子进入细胞之后，在非特异的酯酶水解作用下去 AM 前体，形成 pH 敏感、具有荧光信号的BCECF 探针，从而被滞留在细胞内产生明亮的荧光信号。一般来讲，BCECF 可在胞浆内自由的游离分布并富集，并不能扩散至胞外。

1. 制备细胞悬液，细胞密度约为 1×10^6 cells/ml。

注意: 对于贴壁细胞，也请尽量保证细胞浓度约为 10^6 cells/mL，并使用相同的染色条件。

2. 使用缓冲溶液（如 HBSS、PBS 缓冲液等）将 1 mM BCECF AM 储存液稀释100~500 倍。

3. 按体积比 1:1 将稀释的 BCECF AM 染液加入细胞悬液中，混匀。4℃或 37℃孵育15~60 分钟。

4. 使用新鲜的细胞培养液洗涤细胞，重复一次。

5. 使用荧光显微镜或带有图像分析系统的激光共聚显微镜检测细胞的荧光强度。

组织样本染色：

组织样本的染色处理方法与哺乳动物细胞染色类似，比如大鼠动脉、大鼠唾液腺和胰腺、大鼠肾脏、兔胃腺体等。

1. 处理这些组织样本时，将样本安置在灌注室，建议以 1~5 μM 的 BCECF,AM 工作浓度配制好灌流液，灌注时间为 5~60 分钟。随后用未改性的灌流液（普通灌流液）充分洗涤样本。

2. 对于细胞间质的 pH 测量，可以通过直接注射 0.2~0.5 mM BCECF 酸的方法，获得一个短暂的脉冲。BCECF 酸可以通过扩散作用被加载到分离的细胞或组织切片中，再通过荧光成像仪成像、或用电生理记录仪记录。

其它类型细胞染色：

细菌：革兰氏阳性菌和阴性菌都可以通过简单的酸休克反应（0.5 mM BCECF 酸溶于5 mM 的 HCl 溶液中，处理细菌细胞 5 分钟）从而完成 BCECF 染色。置于冰上孵育时，染料可以很好的滞留在细胞内 ，但在乳糖的刺激下可以导致电位变化，继而导致染料自胞内快速流出。

真菌：尝试用浓度为 10 μM 的 BCECF AM 的孵育细胞，但结果显示染料对这两种菌的染色效果并不理想，可能是由于酵母细胞内的酯酶水解效率较低，在Neurospora crassa 真菌内染色的结果甚至为染料不均匀分布，导致出现空泡堆积。

植物：培养悬浮原生质体（2×106 cells/ml），利用低浓度（10 nM）的 BCECF AM 可以得到染料在胞内均匀分布的结果，而高浓度（3 μM）的 BCECF AM 在加载到玉米根毛细胞中的结果显示染料基本富集于液泡中。

案例分析：

注意事项：

荧光染料不可避免的存在淬灭问题，请存放及操作时尽量注意避光，以减缓荧光的淬灭。

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。